肠道菌群专栏介绍

人体消化道承载的微生物数量超过10 14 ，其中细菌占99%以上，约1000-1150种，他们被称为人类的 第二大基因组——肠道菌群。近年来，随着分⼦生物学、基因组学、生物信息分析技术、高通量测序技术及微生物培养技术的高速发展，肠道菌群对肠道和肠道外疾病的影响及作用越来越明确。肠道菌群更像是具备代谢、免疫和内分泌功能的器官，可以影响人体消化系统、循环系统和神经系统，与人类各种慢性疾病（糖尿病、高血压、心血管疾病和脑部疾病等）及肿瘤的发生密切相关。研究肠道菌群与人体健康和疾病的相互关系，不仅是重要的科学研究，更具有临床诊断、治疗、乃至转化的重要意义和价值。

世界各国在过去十多年启动了多个大型微生物组计划，系统研究微生物组与人类的互作关系，中国于 2017年12月也启动了“ 中国科学院微生物组计划”。作为近年来的研究热点，几乎各临床子学科均可与肠道菌群建立关联研究，包括药学、消化系统疾病、循环系统、药理、肿瘤及中西医结合等诸多方向。同时肠道菌群相关研究也受到国内各种自然基金的资助和青睐。从 2018国家自然科学基金评审结果：肠道微生物研究可见相关立项近166项，总计8469万元研究经费。2019年国家自然基金批准肠道菌群相关210 项，增长趋势明显。而且与肠道菌群相关的研究也更易发表高分SCI文章，经常登上CNS正刊。

然而随着研究的深入，肠道菌群与疾病的研究要求越来越高，如果说2年前依据不同样本进行高通量测序鉴定菌群差异即可发一个不错的文章（如多项胃肠道肿瘤相关菌群研究发表在GUT、GASTROENTEROLOGY上），现在这项技术只能作为一个简单的相关性检测手段。

那么“后肠道菌群时代”究竟该如何设计肠道菌群与疾病相关研究（相关性、因果关系和机制探究三步走）？可以和哪些研究手段结合进行分析（代谢组学、 数据挖掘）？如何选择肠道菌群研究的创新点（FMT、益生元、药物干预…）？如何读懂高分的微生物研究套路? 肠道菌群与疾病的研究已经开始从传统的多组学层面的宏观研究转为特定菌株层面的精细化研究， 医学方肠道菌群专题将系统带你从入门到进阶，顺利发SCI，成功申请国自然。

细菌、酵母、真菌、原生动物、古细菌和病毒定植在人体表面，共同构成人体微生物组。人体微生物群在调节宿主代谢方面起着核心作用，同时也调节人体免疫系统的正常发育和功能。近年来由于新一代测序方法、细菌培养技术和专门的动物模型，对微生物组有了更深入的研究，其中细菌的研究最为广泛。

大多数肠道细菌是厌氧的，厌氧培养方法的发展使以前认为不能在实验室条件下培养的许多菌株的分离成为可能，同时 限菌动物（ gnotobioticanimals，通常是老鼠）作为微生物组研究的模型得以广泛应用。gnotobiotic还包括无菌动物（GF），GF小鼠免疫系统严重发育不全，但无特定病原体（SPF）小鼠体内的定植菌可以在很大程度上纠正这些缺陷，说明菌群在调控免疫系统成熟方面具有深远的作用。使用 限菌小鼠可以深入研究特定微生物与癌症进展以及免疫系统相互作用的机制，从而影响癌症治疗。在人的一生中，即便是健康个体，其肠道菌群组成也是逐渐变化的，这意味着不同人所共生的微生物群落差异很大。而 广泛变化的共生微生物组，也是个体间疾病发展和/或治疗效能差异的潜在来源。

01

肠道菌群在肿瘤发展、抗肿瘤免疫和治疗反应中的作用

1.1 肠道菌群对胃肠道肿瘤发展的影响

肠道菌群的某些细菌成分可以诱发胃肠道组织中肿瘤的发生（图1）。多项研究证明幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）与萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生以及胃癌进展之间存在密切联系。根除幽门螺杆菌是降低HP引起的胃癌发生风险的重要方法。HP感染可通过多种机制促进胃癌的发生，包括释放毒力因子（如CagA、VacA等）以及引发胃上皮细胞内质网应激、自噬和氧化应激反应。但一些研究表明HP与食道腺癌（EAC）发生风险呈负相关，一定条件下具有保护作用。近年来新的研究发现非HP同样与胃癌的发生有关。

具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）在结直肠癌（CRC）中得到了广泛的研究。CRC中F. nucleatum的富集被证实与腺瘤向癌的恶性转化有关。同时瘤内F. nucleatum高水平的患者生存率更低。F. nucleatum和Bacteroides fragilis可以激活β-catenin信号和诱发炎症反应，从而促进CRC的发展。瘤内F. nucleatum还能与人NK和T细胞上的受体TIGIT结合，从而促进结肠癌细胞的免疫逃逸。F. nucleatum也被报道与CRC患者对化疗的耐药性有关，其高丰度可以预测CRC的复发。

有研究发现，肠道微生物组或肿瘤组织中Fusobacterium的富集伴随着Campylobacter的增加。一些侵袭性Campylobacter通过IL-18引发炎症反应从而促进肿瘤发展。大肠杆菌产生的有毒代谢产物colibactin通过激活恶性或癌前上皮细胞中衰老相关分泌表型（SASP），也可以促进CRC进展。SASP与多种生长因子、细胞因子、趋化因子和酶的分泌有关。

1.2 肠道微生物群对胃肠道外组织肿瘤发展的远距离影响

1.2.1 肠道细菌向胰腺肿瘤的易位

肠道的细菌可以转移到其他密切相关的组织并影响肿瘤进展，如用荧光标记的共生菌给小鼠喂食可以观察到其从肠腔室转移到胰腺。Gammaproteobacteria从肠道通过胰管转移到胰腺肿瘤后可以代谢活化的药物吉西他滨（gemcitabine）并降低其有效性。在胰腺癌（PDAC）的小鼠模型中，共生微生物群的存在加速了Kras诱发肿瘤的生长。抗生素治疗可以提高自发性抗肿瘤免疫，也可能提高抗pd-1治疗的疗效。另一项研究显示，肿瘤微生物群的组成和多样性与CD8+ T细胞反应太高和PDAC患者生存期的延长有关。16SrDNA测序发现，Sachharopolyspora,Pseudoxanthomonas, Streptomyces和Bacillusclausii在胰腺肿瘤内富集，可以用于预测生存期。

这些研究表明肠道菌群、肿瘤菌群和胰腺癌进展之间存在交互作用。肿瘤进展可以影响肠道菌群的组成，肠道菌群也可以塑造肿瘤微环境，从而调节抗肿瘤免疫应答反应。利用肠道菌群组成还可以作为预测生存或治疗方法的生物标志物。此外，靶向肠道菌群可以作为改善PDAC患者化疗或免疫治疗效果的一种潜在治疗方法。

1.2.2 肠道菌群对肝癌的影响

肠道细菌产生的代谢物、PAMPs和抗原可以通过肝门静脉转运到肝脏。肝脏由大量免疫细胞组成，是肠道微生物与免疫系统相互作用的重要场所。研究证实的在肝脏中促进致癌或抗肿瘤免疫的肠道细菌代谢物有：二级胆汁酸（BAs）、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS通过TLR4传递信号）和脂磷壁酸（LTA，通过TLR2发出信号）。

初级BAs在肝脏中由胆固醇合成，并与胆汁分泌的氨基酸（如牛磺酸和甘氨酸）结合，进入十二指肠以帮助脂质吸收。小肠末端和结肠的肠道细菌可以代谢BA，产生多种次级BA，二级BAs可被结肠被动吸收并返回肝脏，同时次级BAs可以发挥免疫调节功能。大部分次级BAs是由革兰氏阳性Clostridiumcluster XVI进行的7α-去羟基化反应生成的。实验证明次级BAs，如石胆酸或小鼠特异性ω-muricholicacid，有助于小鼠原发性或转移性肝癌的发生。高脂肪饮食可以引起某些Clostridium在小鼠肠道中富集，导致次级BA脱氧胆酸（DCA）的大量产生。肝脏中DCA和LTA的积累加速了肝癌的进展。LTA和DCA协同刺激TLR2通路诱导肝星状细胞（HSCs）衰老和COX2过表达。COX2积累导致PGE2的过量产生，进而通过抑制抗肿瘤免疫并加速肿瘤发展。在肝脏中LPS同样介导了微生物驱动肿瘤的发生，TLR4激活上调星状细胞中肝素调节蛋白的表达，在慢性损伤诱导的肝癌模型中表现出促肿瘤作用。

1.2.3 肠道菌群对癌症的系统性影响

肠道微生物群可以通过多种信号机制影响宿主几乎所有器官和系统的功能。例如，肠道微生物群可以调节血液循环中雌激素水平从而影响性激素诱发癌症的风险（子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌）。细菌代谢产物，包括短链脂肪酸（SCFAs），次级BAs，尸胺和肠寡聚糖，可以进入宿主血液循环影响癌症进展。

肠道菌群通过脑肠轴与中枢神经系统（CNS）紧密相连。细菌可以通过产生多种激素直接向中枢神经系统发送信号，也可以通过激活免疫介导的信号，如激活炎性小体的激活和诱导I型干扰素间接向中枢神经系统发出信号。肠道菌群与脑肿瘤发展之间的确切机制尚未建立，由肠道菌群导致的神经炎症可能是一个促癌因素。也有研究认为，肠脑轴可能构成肠道微生物群系统调控癌症进展的一个重要途径。

1.2.4 肠道菌群对抗肿瘤免疫和免疫治疗效果的影响

肿瘤的发展与免疫系统有着错综复杂的关联。由此可见，肠道菌群对肿瘤的影响可能是通过调节免疫系统来介导的。有研究利用小鼠模型初步鉴定出肠道菌群在CpG-寡核苷酸免疫治疗和免疫刺激环磷酰胺化疗中的作用。进一步研究证实双歧杆菌和脆弱芽孢杆菌对小鼠模型免疫的刺激作用，可以增强检查点封锁免疫治疗（抗PD-L l1和抗CTLA-4）的疗效。口服双歧杆菌可以增强树突状细胞的活化并改善肿瘤特异性CD8+ T细胞应答，而脆弱拟杆菌可以激活抗肿瘤TH1细胞。

那么微生物菌群和抗PD-1免疫治疗在癌症患者中是否有机制联系。通过16S和宏基因组分析粪便微生物群发现免疫应答者和无应答者之间微生物群组成具有差异，使用具有癌症患者肠道菌群的GF小鼠可以证实菌群和抗肿瘤免疫之间具有关联。临床研究也证实了造血干细胞移植后患者肠道菌群的影响，肠道细菌种群多样性越高，与移植相关死亡的风险越低。进一步的分析表明，Proteobacteria与移植后较高的死亡率相关，Enterococcus与移植物抗宿主病的较高风险相关。上述研究表明肠道菌群可以对免疫系统产生系统性影响，从而影响治疗结果。但肠道微生物介导的免疫调节机制及信号途径仍需要进一步的研究（下图）。

宿主免疫系统通过与肠道菌群不断相互作用来预防感染和维持免疫稳态。肠道共生物通过模式识别受体（PRRs）,微生物相关分子模式（MAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）向肠道相关淋巴组织（GALT）和肠系膜淋巴结（MLN）中的免疫细胞传递信号。PRRs是一大类细胞表面或细胞内的受体，包括toll样受体（TLRs）、RIG-I样受体、节点样受体、C型凝集素受体、AIM2样受体,可以识别细菌、真菌、病毒和原生动物的MAMPs信号，并启动炎症细胞因子信号来消除感染。然而PRR信号通路的延长可导致慢性炎症和组织损伤，从而促进肿瘤的发展。

肠道共生体也是抗原的来源，可以被M细胞摄取并运输到支系细胞斑块中，从而起始抗原特异性的B细胞反应。杯状细胞也可以将细菌抗原从管腔引导到固有层中树突状细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞（APCs）。装载抗原的APCs可以将抗原运送到固有层内的淋巴滤泡或MLN，从而激活抗原特异性T细胞反应。微生物抗原在肿瘤进展和治疗中的重要性在环己酰亚胺化疗研究中得到了例证，诱导Enterococcus hirae从肠道转位到MLN和脾脏，可以改善抗肿瘤免疫。

肠道菌群也可以通过释放各种代谢物来影响免疫系统，这些代谢物可以进入血液循环。SCFAs由微生物发酵膳食纤维产生，可通过G蛋白偶联受体传递信号，或作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，激活基因的表达。SCFAs对抗炎Treg细胞或促炎TH1和TH17细胞的分化和激活具有多方面的作用。细菌代谢物也可以在不进行免疫治疗的情况下改变宿主炎症情况。丁酸、丙酸等短链脂肪酸可通过表观遗传修饰诱导Treg分化，丁酸盐可增加CD8+ T细胞中IFN-γ和GrzmB的表达，并诱导CD8+T细胞向记忆T细胞转化。

目前研究人员在微生物与免疫研究中广泛关注的是鉴定可能影响调节免疫检查点封锁治疗临床结果的细菌。B. pseudolongum代谢产物肌苷在结肠直肠癌小鼠模型中可以改变免疫治疗效果。肌苷诱导CD4+T细胞中TH1基因的表达，加入免疫检查点抑制剂导致IFN-γ增加。同时，检查点阻断疗法和肌苷抗肿瘤活性需要CpG和树突状细胞分泌的IL-12的协同刺激。Akkermansia muciniphila同样可以产生肌苷，具有相同的抗肿瘤作用。

02

微生物组调制治疗癌症的治疗策略

目前多项研究开始基于已确定的肠道微生物群对抗肿瘤免疫和免疫治疗效果的调节进行临床试验，以治疗目的研究肠道菌群。使用粪便微生物移植或确定的细菌分离物，以增强免疫增强细菌的作用，同时减少免疫调节细菌的作用。

2.1 粪菌移植（FecalMicrobiota Transplantation：FMT）

FMT主要通过将健康捐献者的粪便转移给受体，目前被广泛用于治疗艰难梭菌感染、溃疡性结肠炎和其他胃肠道疾病。研究证实FMT用于复发性艰难梭菌感染可以改善患者状况和解决临床症状。最近，FMT开始与检查点封锁疗法联合研究，从癌症患者到GF小鼠的FMT能够再现应答/无应答表型。使用抗PD-1治疗有应答患者的粪便转移给GF小鼠，相应的小鼠也对PD-1阻断有应答，而用无应答粪便转移的GF小鼠对PD-1阻断无应答。另一个临床研究发现，接受广谱抗生素治疗的患者中抗PD-1的疗效降低。以这些观察结果为基础，临床干预措施恢复有利的菌群研究正在进行中。

目前正在进行多项临床研究，主要针对转移性黑色素瘤患者，评估FMT增强免疫检查点封锁疗法的潜力。前列腺癌、胃肠癌和间皮瘤的临床试验也在进行中。这些临床研究的一般策略是，选择对抗PD-1药物有完全反应的患者中作为候选粪便供体。虽然接受免疫治疗的FMT患者的早期临床试验有了好的结果，但研究人员在使用FMT时仍需谨慎。致病菌、寄生虫、噬菌体和多药耐药菌可能从粪便材料转移给患者。有报道接受FMT治疗的两名患者，一名是肝性脑病，另一名是骨髓增生异常综合征，发生了严重的细菌感染而死亡。最近的一项研究评估了候选FMT供体的粪便，通过多种标准（包括病原体和耐抗生素细菌的检测）来确定它们是否适合临床使用，结果表明只有3%的供体能够通过这种质量控制评估。

FMT的另一个问题是要确定哪些患者因为微生物群缺陷而无法进行抗PD-1治疗。随着肠道微生物调节宿主抗肿瘤免疫的生化和细胞机制越来越明确，以及随着功能相关细菌（阳性和阴性）的鉴定越来越清楚，对于特定患者的适宜FMT供体选择应该会变得更加容易。

2.2 细菌分离和菌株组合

使用已鉴定的细菌有可能减轻FMT传递病原体的风险，与不同供体肠道菌群相比，还可以提供一致性的治疗产品，变异性较小。多项临床前和临床相关数据表明双歧杆菌种具有促进抗肿瘤T细胞应答和抗PD-1作用的潜力。给小鼠注射Bifidobacteriumanimalis lactis（EDP1503）时，该菌株在小肠具有免疫增强活性并诱导广泛的免疫反应，包括诱导炎症细胞因子、T细胞反应和NK细胞激活。使用EDP1503联合使用pembrolizumab治疗三阴性乳腺癌患者，在6名可评估患者中有2名应答，同时单药抗PD-1治疗的应答率在5-10%之间。初步研究分析显示，EDP1503治疗2周后，CD8+T细胞增加，这与预期的免疫作用机制一致。

在另一项单独的临床研究中，使用了7种拟杆菌属（Bacteroidales）和4种非拟杆菌属菌株的组合，这些菌株已被证明能增加小鼠肿瘤模型中的细胞毒性CD8+T细胞数量，并增强抗PD-1反应。进一步研究表明主要是4个非拟杆菌门菌株对CD8+T细胞具有增强作用，联合11个菌株后作用更大。

2.3 益生菌（Probiotics）

使用益生菌来改变微生物群是另一种肿瘤治疗背景下的研究策略。对黑色素瘤患者生活方式调查的回顾性分析初步数据显示，非处方益生菌对免疫检查点抑制剂治疗的反应有负作用，非处方益生菌的治疗效果是否依赖于肿瘤适应症以及特定益生菌的组成仍有待观察。有研究证明，在结直肠癌中益生菌可以调节肿瘤菌群，并改变肿瘤炎症细胞因子。

03

瘤内菌群:其他组织的菌群可以独立于肠道菌群调节局部肿瘤的进展

人体其他粘膜部位的微生物组也可能独立于肠道微生物群，在局部肿瘤的发展中发挥作用。在诱导型肺腺癌小鼠模型中，常规SPF小鼠的肺肿瘤负荷高于GF小鼠，这是由肺微生物的局部效应驱动的。与非荷瘤小鼠相比，荷瘤小鼠肺菌群具有更高的细菌负荷、明显的分类组成和较低的多样性。从晚期肺肿瘤中分离出来的细菌可以加速肿瘤的进展。最初认为乳腺组织是无菌的，现在许多临床研究表明，与健康乳腺组织相比，乳腺癌活检具有独特的细菌组成，但对与乳腺癌相关的细菌分类还没有明确的共识。

其他研究也表明，细菌存在于更多类型的肿瘤组织中，可能在肿瘤进展和免疫中发挥作用。来自TCGA的全基因组测序数据分析显示，各种类型癌症组织和癌症患者血液中的微生物基因相似，包括之前被认为是无菌的身体内部癌症组织。目前已证实细菌存在于肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞中，包括乳腺癌、骨、肺、卵巢、脑、胰腺和黑色素瘤。

肿瘤具有独特的微环境，乳腺肿瘤具有多样性最高的微生物群，有一部分检测到的细菌是可培养的。这些细胞内细菌很大程度上缺乏细胞壁，这表明其呈l型状态。这种特性使得它们对针对细胞壁合成的抗生素产生耐药性，有人认为l型状态的病原体清除效率低是感染反复的原因。这些瘤内细菌的初始来源是什么，它们是否与肿瘤发生、肿瘤进展或对治疗的反应仍需要进一步的研究。

04

结论

人体共生菌群对宿主免疫系统的影响，被认为是影响抗肿瘤免疫和治疗效果的重要因素之一。目前利用具有免疫刺激特性的微生物制剂（如FMT，更明确的菌群，或益生菌菌株）来提高癌症免疫治疗疗效的临床方法，仍处于起步阶段。深入了解微生物调节免疫的机制，并识别免疫刺激和免疫抑制相关细菌菌株，可以提高治疗方法的有效性，从而有助于避免感染风险和不良后果。除给予微生物制剂或代谢物，靶向清除免疫抑制细菌也可以增加免疫治疗结果。通过高通量测序、qPCR检测患者的微生物群，可以帮助选择最佳治疗方案。通过筛查特定微生物组成可以识别出罹患癌症的高风险个体，对癌症预防有积极影响。

这篇2020年发表在Gastroenterology一篇综述文章，详细介绍了在结直肠癌、肝癌、胃癌及胰腺癌等癌症中，肠道菌群对肿瘤发生发展、局部及全身的抗肿瘤免疫应答、PD-1单抗及CTLA-4单抗等肿瘤免疫治疗的调控机制。对于肠道菌群相关的研究，具有很好的指导意义。

参考文献：

[1]Matson V, Chervin CS, Gajewski TF. Cancer and the Microbiome: Influence of thecommensal microbiota on cancer, immune responses, and immunotherapy.Gastroenterology 2020.

END

征 稿 启 事

“医学方”始终致力于服务“医学人”，将最前沿、最有价值的临床、科研原创文章推送给各位临床医师、科研人员。