2021年中国林业科学院林木遗传育种国家重点实验室李全梓研究员课题组在Journal of Integrative Plant Biology杂志上发表了题为“Single‐cell RNA sequencing reveals a high‐resolution cell atlas of xylem in Populus”的研究论文。该研究是林木中首次对木质部进行单细胞测序分析，提出了林木木质部细胞分化过程中潜在的分子调控网络。

主要结果

作者使用10×Genomics平台对杨树84K进行了单细胞测序，以研究杨树的木材形成。这组样品一共捕获了10,646个细胞用于文库构建和双末端测序，对测序结果进行过滤，去除基因数小于500和超过10,000及UMI超过30,000的细胞后，最终保留了9,798个高质量细胞用于进一步分析。

利用Seurat对9798个细胞进行无监督聚类分析，所有细胞可以分成12个cluster（图2A-B，resolution为0.6）。为了获得12个簇中细胞类型的基本信息，作者分析了每个簇中上调的差异表达基因（DEGs）。

对DEGs进行KEGG和GO分析，以了解它们的潜在功能和可能参与的调控途径。GO分析结果显示，cluster 2、6、7和cluster 10在木聚糖生物合成、半纤维素生物合成、细胞壁多糖生物合成和细胞壁大分子生物合成中显著富集（图2C），这些生物过程都与木材形成息息相关。KEGG分析结果显示，cluster 2、6、7同时也在苯丙氨酸代谢和戊糖磷酸途径显著富集（图2D），这些途径都与木质素的生物合成紧密相关。因此，cluster 2、6、7的细胞可能处于导管或纤维细胞的次生细胞壁（SCW）增厚阶段。同样，cluster 0、4、9和cluster 10在核糖核蛋白复合物（GO）和核糖体的形成(KEGG)中显著富集；cluster 3、5、8和cluster 11在植物MAPK信号通路和内质网蛋白加工途径中富集。与其他cluster相比，cluster 1在GO和KEGG分析中都没有明显的功能富集，这表明它可能是出于最早发育阶段的细胞集。

为了区分cluster 2、6和7中的导管和纤维细胞类型，作者分别分析了两种细胞marker基因在cluster 2、6和7中的表达模式。与纤维细胞不同，导管分子是一种SCW增厚后死亡的特殊的Treachery Elements（TEs）。TEs通过一系列蛋白水解和水解过程进行程序性死亡（PCD）。DEGs分析结果显示，PCD相关蛋白水解酶编码基因在cluster 7的细胞中特异性显著上调，因此推测cluster 7为导管分子细胞。而cluster 2和6共享大多数DEGs，可能这两个cluster是同一类型的不同发展阶段的细胞。根据纤维细胞marker基因（如PagCslA1、MYB148等）的表达模式，推测cluster 2、6为纤维细胞。

余下9个cluster中可用的marker基因数量有限。为了鉴定细胞类型，作者从每个簇中选择了一个特异性上调的基因进行RNA原位杂交实验（RISH）。

根据scRNA-seq数据，Pop_A10G001185（cluster 1）在所有其它cluster中也均有表达（图3A）；其RISH结果与scRNA-seq数据一致，在所有细胞类型中检测到其表达水平，包括木质部和韧皮部中的导管（Ve）、射线薄壁组织细胞（Rc）和纤维细胞（Fc/Pfc）（图3B），表明cluster 1具有较低的异质性。Pop_A01G004551（cluster 8）和Pop_A06G063029（cluster 11）在纤维细胞和射线细胞中均表达。Pop_A19G053004（cluster 3）和Pop_G01G010746（cluster 5）在射线薄壁组织细胞中显示出高RNA丰度，韧皮部纤维中没有信号，表明cluster 3、5是处于不同发育阶段的射线薄壁组织细胞。Pop_A14G000834（cluster 10）在导管中高表达，表明cluster10为正在分化的导管细胞。

为了研究木质部形成过程中的细胞分化过程，作者对所有细胞进行了伪时间轨迹分析。根据前期数据，cluster7和cluster10是处于不同发育阶段的导管细胞，伪时间分析结果也再次证实了这一点，分化轨迹为1→10→7，分化程度逐渐增加（图4A），因此作者将cluster 10命名为VeI，cluster 7命名为VeII（图4A、C）。同理，作者确定了射线细胞（cluster 11→3→5）的发育路径、纤维细胞（cluster6→2）的发育路径，并确定cluster8为纤维细胞和射线细胞的前体细胞（图4 B-C）。

为了确定调控细胞分化的基因，作者检测了导管、纤维细胞和射线细胞分化轨迹上的基因表达模式。根据表达量将导管DEGs分成3个簇，将纤维细胞DEGs分为5个簇，将射线细胞DEGs分成7个簇（图6A-C）。随后，作者利用各组DEGs伪时间轨迹的表达模式和Branching Expression Analysis Modeling (BEAM)，整合出杨树木质部细胞分化调控网络（图6D）。并提出，PagSND2和PagMYB42可能是导管分化的重要调节因子。在纤维细胞分化过程中，PagSND1可能在纤维细胞分化过程中的两个分支点启动纤维细胞分化和SCW增厚。

评述

这是林木在单细胞测序领域的第二篇文章，也是林木中第一个利用原生质体进行ScRNA-seq的研究。木材是林木育种重要的研究方向，该研究以84K杨树为对象直击林木木质部细胞的分化过程，提出了明确的木质部细胞分化轨迹及潜在的调控网络，为林木育种和相关分子调控机制研究提供了更丰富、更深入的数据支撑及研究思路的指引。

原文链接：

END