生物化学实验指导

实验一蛋白质的性质实验（一）（呈色反应）

一、目的

1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。

2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法

二、虽色反应：

(一)双缩脱反应：

1.原理：

尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu

2+

结合生成

紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生

此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。

一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或

多肽。

2.试剂：

(1)尿索：10克

(2)10%氢氧化钠溶液250毫升

(3)1%硫酸铜溶液60毫升

(4)2％卵清蛋白溶液80毫升

3.操作方法：

取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止

加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫

酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化

铜能掩盖粉红色。

向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜

溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。

(二)茚三酮反应

1.原理：

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚

三酮反应生成蓝紫色物质。

该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定

量测定方法。

茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成

还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物

质。

反应机理如下：

此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸

度过大时甚至不显色。

2.试剂：

(1)蛋白质溶液100毫升

2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9)

(2)0.5％甘氨酸溶液80毫升

(3)0.1％茚三酮水溶液50毫升

(4)0.1％茚三酮—乙醇溶液20毫升

3.操作方法：

(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水

溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。

(2)在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％的茚三

酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

(三)黄色反应：

1.原理：

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱

性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：

多数蛋白质分子台有带苯坏的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓

硫酸才有黄色反应。

2.试剂：

(1)鸡蛋清溶液100毫升

将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。

(2)大豆提取液100毫升

将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。

(3)头发

(4)指甲

(5)0.5％苯酚溶液50毫升

(6)浓硝酸200毫升

(7)0.3％色氨酸溶液10毫升

(8)0.3％酪氨酸溶液10毫升

(9)10％氢氧化钠溶液100毫升

3.操作方法：

向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微

火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10％氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

(四)乙醛酸反应

1.原理：

在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质,反应机理尚不清楚，可能是一分子乙

醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。

含有色氨酸的蛋白质也有此反应。

2.试剂：

(1)蛋白质溶液100毫升

鸡蛋清：水＝1：20

(2)0.03％色氨酸溶液10毫升

(3)冰醋酸200毫升

(4)浓硫酸(分析纯)100毫升

3.操作方法：

取3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2

毫升。混匀后倾斜试试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约I毫升，静置。观察各管液面间紫色环

的出现。若不明显，可于水浴中微热

实验二蛋白质的性质实验（二）（沉淀反应）

一、蛋白质等电点的测定：

1.目的：

(1)了解蛋白质的两性解离性质。

(2)学习测定蛋白质等电点的一种方法

2.原理：

蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：

蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋

白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶

液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的

理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解

度最低时的溶液pH值。

本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混

合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最

多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

3.器材：

(1)水浴锅。

(2)温度计。

(3)200毫升锥形瓶。

(4)100毫升容量瓶。

(5)吸管。

(6)试管。

(7)试管架。

(8)乳钵。

4.试剂：

(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200毫升

取0.4克酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研6，将所得的蛋白质悬波移入200毫升锥形

瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10毫升1 当量/升醋酸

钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶

内的溶液全部移至100 毫升容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。

(2)1.00 当量／升醋酸溶液 100 毫升

(3)0.10 当量／升醋酸溶液 100 毫升

(4)0.01 当量／升醋酸溶液 50 毫升

5.操作方法：

(1)取同样规格的试营4 支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。

(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1 毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4 管

的pH 值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10 分钟后，再观察其混浊度。最混浊

的一管的pH 即为酪蛋白的等电点。

二、蛋白厦的沉淀及变性：

1.目的：

(1)加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

(2)了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

(3)了解蛋白质变性与沉淀的关系。

2.原理：

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在

一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类。

(1)可逆的沉淀反应：

此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解

于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或

丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。

(2)不可逆沉淀反应：

此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热

引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金届离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白

质并不一定部表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

3.试刘与材料：

(1)蛋白质溶液 500 毫升

5％卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液

(新鲜鸡蛋清：水＝1：9)

(2)pH4.7 醋酸—醋酸钠的缓冲溶液 100 毫升

(3)3%硝酸银溶液 10 毫升

(4)5％三氯乙酸溶液 50 毫升

(5)95％乙醇 250 毫升

(6)饱和硫酸铵溶液 250 毫升

(7)硫酸铵结晶粉末 1000 克

(8)0.1 当量／升盐酸溶液 300 毫升

(9)0.1 当星／升氢氧化钠溶液 100 毫升

(10)0.1 当员／升碳酸钠溶液 100 毫升

(11)0.1 当量／升醋酸溶液 100 毫升

(12)甲基红溶液 20 毫升

(13)2％氯化钡溶液 150 毫升

4.操作方法：

(1)蛋白质的盐析。

无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也

不同。

如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由

盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。

加5％卵靖蛋白溶液5 毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析

出球蛋白的沉淀。倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液

中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，l 此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏

水，观察沉淀的再溶解。

(2)重金属离子沉淀蛋白质

重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取一支试管，加入蛋白质溶液2 毫升，再加

3％硝酸银溶液1～2 滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾出上消液，向沉淀中加入少量的

水，沉淀是否溶解？为什么？

(3)某些有机酸沉淀蛋白质

取一支试管，加入蛋白质溶液2 毫升，再加入1 毫升5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉

淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。

(4)有机溶剂沉淀蛋白质

取一支试管，加入2 毫升蛋白质溶液，再加入2 毫升95％乙醇。混匀，观察沉淀的生成。

(5)乙醇引起的变性与沉淀

取3 支试管，编号。依下表顺序加入试剂：

振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水 8 毫升，然后在第 2、3 号管中

各加一滴甲基红．再分别用0.1 当量／升醋酸溶液及0.1 当星／升碳酸钠溶液中和之。观察各管

颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1 当量／升盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管

发生的全部现象。

实验二蛋白质的两性反应及等电点的测定

蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，

白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子

不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。当

液的pH 值低于蛋白质等电点时，即在 H 较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为

—

离子，当溶液的pH 值大于等电点时，即在OH 较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成

阴离子。

本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点

蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。

(三) 蛋白质的沉淀反应

蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗

粒的稳定性是有条件的、 相对的。 在一定的物理化学因素影响下， 蛋白质颗粒失去电荷、

脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的

沉淀反应。该反应可分为以下两种类型:

1. 可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，

基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉

淀反应称为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白

质的短时间作用以及等电点沉淀等。

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。 蛋白质是亲水

胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带

的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天

4 然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。

沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度、种类不同，所以在不同条件下，采用不同浓

度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，这种方法称为蛋白质的分级盐

析。它在酶的生产和制备等工作中被广泛应用。

2. 不可逆的沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白

质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，

这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、

超生波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。 蛋白质在水溶液中是酸碱两性电

解质，在碱性溶液中（对蛋白质等电点而言） ，蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的

2+ 2+ 2+ 2+ 3+

金属离子，如Zn 、Cu 、Hg 、Pb 、Fe 结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以

其可溶性的钠盐或钾盐存在，当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的

盐类而沉淀。 经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解在水中， 说明它已发生了变性。

重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液

中的蛋白质; 临床上则用蛋白质解除重金属盐食物性中毒。但应注意，过量的醋酸铅或

硫酸铜可使沉淀的蛋白质再溶解。

蛋白质在有机酸的作用下带正电荷， 与酸根的负电荷结合成为溶解度很小的盐类而

沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，可将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此

得到广泛应用。

【实验试剂和器材】

（一）试剂

1. 卵清蛋白溶液：取 5ml 鸡蛋清，用蒸馏水稀释至 100ml，搅拌均匀后用 4— 层

纱布过滤,新鲜配制。

2. 0.5% 酪蛋白(以 0.01N NaOH 作溶剂)

3. 酪蛋白-醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白 0.25 克，加蒸馏水 20ml 及 1.00N NaOH 溶

液 5ml (必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00N 醋酸 5ml ((必须准确)，倒入 50ml

蒸馏瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10N 醋酸钠溶液内，酪蛋

白的浓度为 0.5% 。

4. 蛋白质-NaCl 溶液: 取 20ml 蛋清,加蒸馏水 200ml 和饱和氯化钠溶液 100ml，充

分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白） 。

5. 0.5% 甘氨酸，0.3% 酪氨酸，0.5% 色氨酸 6. 尿素，双缩脲试剂，0.1%茚三酮乙醇

溶液，浓硝酸，10%NaOH

7. 0.01%溴甲酚绿指示剂， 0.02N HCl， 0.02N NaOH， 0.01N HAc， 0.10 N HAc， 1.00N

HAc

8. 饱和硫酸铵溶液, 硫酸铵粉末, 2%硝酸银, 0.1%硫酸铜, 饱和硫酸铜, 10%三氯乙

酸,

（二）器材

试管及试管架，酒精灯，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管，恒温水浴。

【实验方法】

1. 双缩脲反应

取少量尿素结晶，加入干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化

时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后加入 10 滴双缩脲试剂，混匀, 观察颜