发表单位：复旦大学中山医院生物医学研究丁琛团队

血浆蛋白质组学怎么设计课题？

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研究背景

结直肠癌(CRC)是全球第三大常见癌症，也是癌症死亡的第二大常见原因。早期筛查可以降低癌症死亡率，目前筛查方法有无创粪便隐血试验、粪便免疫化学试验、癌胚抗原试验和结肠镜检查。

然而，疾病进展缓慢且无症状的特点给早期诊断带来了挑战，严重降低了及时发现和干预疾病的机会。因此，迫切需要探索潜在的生物标志物来区分结直肠癌患者和健康对照，从而提高无创准确诊断策略。20多年的转化和临床研究经验得出ERGF家族及其细胞内信号通路仍然是CRC靶向分子治疗的最好方法。

西妥昔单抗是一种针对ERGF的嵌合单克隆抗体，以高亲和力特异性结合ERGF。然而，在实际的治疗中发现西妥昔单抗具有耐药性，因此，迫切需要寻找西妥昔单抗首次治疗反应和多次治疗反应的潜在预测性生物标志物。组织和血液的临床分析是支持患者治疗决策的最常用方法，血液中循环的蛋白质既可以是器官串扰的介质，也可以是全身状态的标记物。因此，用血液蛋白质组寻找生物标记物是最好的素材。

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材料和方法

该研究共纳入756份血浆样本：

1、发现队列：116名接受抗ERGF治疗的CRC患者和66名健康对照(HC)，收集了连续多疗程抗ERGF治疗的结直肠癌患者的89份治疗前血浆和385份治疗后血浆。

2、验证队列：31名CRC和24名HC，收集了31份治疗前血浆样本和46份治疗后血浆。

3、31例therapy-naïve CRC患者的31个肿瘤组织和27对NATs，与独立组织验证队列中的血浆样本相匹配。

4、95名多癌症患者和20名HC队列，癌症类型包括结直肠癌(CRC， N = 20)、肺癌(LC，N = 15)、恶性淋巴瘤(ML， N = 10)、膀胱癌(BLCA， N = 10)、乳腺癌(BRCA，N = 15)、胃癌(GC， N = 10)、食管癌(EC， N = 15）。共115份血浆样本。

5、纵向队列是治疗期间9个采样时间点。

1、CRC患者的单细胞转录组数据（公共数据库登录号GSE108989）

2、HPA数据库的免疫组化(IHC)染色数据

3、蛋白质组学肿瘤分析联盟(CPTAC)的一个独立的结直肠癌队列数据集

4、TIMER2.0数据库TCGA公共CRC队列的转录组学数据。

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研究结果

1、血浆蛋白质组学生物标志物可以区分结直肠癌患者与健康人群

首先测量下质谱仪器运行的稳定性，将所有血浆样品的混合物每20个样品测量一次，发现对照样品间的平均相关系数为0.978，表明MS平台具有一致性稳定性。其次做蛋白质组学检测分析，发现每个样品中得到1587-2502个基因产物；发现队列的所有血浆样本共鉴定出9852个基因产物，其中CRC患者中鉴定出9714个，HC 中鉴定出7512个。

为了探讨CRC患者与健康人群的分子差异，作者对治疗前的CRC 和HC进行了比较蛋白质组学分析，发现13.2%的蛋白被鉴定出来。其中CRC相关蛋白占比较高，可以反映CRC的血浆蛋白质分子改变。

CRC组和HC组比较分析发现共有1269个差异表达蛋白，其中CRC组上调了745个蛋白，HC组上调了524个蛋白，KEGG富集分析发现主要在糖酵解/糖异生，ERBB2信号传导，细胞对化学应激的反应，MAPK激活以及结直肠癌患者血浆样品中细胞外基质组织通路富集。31例CRC肿瘤组织和27对NATs蛋白质组学差异表达分析，发现肿瘤组织中有2573个上调蛋白和251个下调蛋白。血浆样本和组织样本中DEPs比较分析发现CRC血浆中有745个上调蛋白，组织中有235个上调蛋白，说明CRC血浆和肿瘤组织中DEPs的重叠比例较高，表明血浆蛋白质组中蛋白质和通路的改变在组织样品中有较好的反映。

为了寻找区分CRC和HC血浆和组织的蛋白质生物标志物，作者对血浆和组织样本进行了严格的筛选策略。结果在CRC患者的血浆和组织样本有15个高表达的重叠蛋白，分别是CPT1A、NUP205、CDC37、MAT2A、RPN1、GMPS、PSMA1、CDH1、SRSF7、FUBP3、PIGR、S100A8、S100A9、THBS2、COL12A1。

为了完善区分CRC和HC 的蛋白质，作者利用CPTAC研究中纳入了另一个独立的结直肠癌队列，采用相同的标准对CPTAC的CRC队列的肿瘤组织和匹配的非肿瘤邻近组织蛋白质组学数据进行两两比较，发现31个蛋白在CRC患者的肿瘤组织中显著过表达。结合三个独立的队列，最终锁定到四种蛋白：COL12A1， THBS2， S100A8和S100A9，作为区分CRC与HC的潜在生物标志物。

此外，利用TIMER2.0数据库TCGA公共CRC队列的转录组学数据和HPA数据库的免疫组化(IHC)染色数据进一步证实了COL12A1、THBS2、S100A8和S100A9在CRC中的高表达。总的来看，这四种蛋白有可能将CRC患者与健康对照区分。

GSEA分析以上四个蛋白之间潜在的生物学关联，发现在含胶原的细胞外基质中，富集；PPI 分析揭示了COL12A1、THBS2、S100A8和S100A9参与ECM的蛋白之间的密切联系。由此来看，这四种生物标志物在含胶原的细胞外基质中显著富集。

此外，作者探讨了这四种蛋白与临床预后的关系。作者发现TCGA CRC队列中这四种蛋白的表达与临床结局呈显著负相关，其中S100A8和S100A9作为潜在的标志物和抑制剂具有已知的临床用途。作者又用机器学习算法计算了血浆发现队列中4种蛋白的受试者ROC曲线下面积(AUC)，发现单个标记的AUC至少为0.674；联合血浆标志物的AUC为0.910。

另外31名CRC和24名HC的独立血浆验证队列中AUC为0.952。总的来看，这四种蛋白可以较好地区分结直肠癌患者与健康人群。

为了消除这四种蛋白无法是否可以区分RAS突变和无转移的CRC患者。作者对20例CRC患者、RAS突变的CRC患者、无转移的CRC患者进行差异分析和ROC分析，发现4种蛋白在20例CRC患者，RAS突变的CRC和无转移的CRC患者中显著上调，AUC分别为为0.948、0.985、0.950，说明四种蛋白可以区分RAS突变和无转移的CRC患者。

此外，作者检索了CPTAC的公共数据分析四种蛋白是否可以区分RAS突变和无转移的结直肠癌患者，结果发现四种蛋白的情况与自测数据结果吻合，说明4种蛋白在CRC诊断中的稳定性和普遍性。通过多癌血浆独立队列发现上述四种蛋白质对多种癌症的诊断具有普遍性。溃疡性结肠炎和感染性疾病相关的公共数据集探索四种蛋白区分某些非恶性疾病患者中的预测功效，差异表达分析显示COL12A1、THBS2、S100A8和S100A9 四种蛋白组合不能区分非恶性疾病患者和健康。

本研究验证了四种蛋白的组合可以很好地区分CRC和HC，不局限于RAS野生型或转移性CRC患者，不能区分其他癌症类型和非恶性疾病的患者。

2、西妥昔单抗治疗初始反应的潜在分子特征和生物标志物

为了寻找患者首次西妥昔单抗治疗后的初始治疗反应的潜在生物标志物，作者研究了89例治疗性CRC患者的血浆蛋白质组，分为敏感(S)，非敏感(NS)类型。诊断性生物标志物的差异分析显示S组和NS组之间没有显著差异，ROC分析也表明四种生物标志物对初始治疗反应的预测较差。因此，用于区分结直肠癌患者与健康对照的诊断性生物标志物不能作为预测初始治疗反应的指标。

图 3 西妥昔单抗敏感性的潜在机制和生物标志物

因此，作者对89份therapy-naïve血浆样本进行共识聚类分析，得到G-I， G-II和G-III 三种亚型:。三种蛋白质组学亚型临床特征统计分析，发现蛋白质组学亚型可以反映与治疗反应的强相关性。从G-I到G-III，治疗反应呈现出逐渐降低的耐药现象。

随后，作者探索了潜在的耐药/敏感机制以及初始治疗反应的生物标志物。ssGSEA评分分析显示，在G-III亚型富集的通路中自噬与中性粒细胞脱粒以及先天免疫系统存在显著相关性，表明自噬与中性粒细胞脱粒和先天免疫系统存在生物学关联。通过xCell分析评估了三种亚型之间的免疫微环境，G-III免疫评分最高， CD8+ Tem在G-III亚型中显著富集，在S组明显占优势。

为了验证这一发现，作者对由12例S患者和19例NS患者组成的独立组织队列蛋白质组数据进行xCell分析，发现S组CD8+Tem的xCell评分明显升高。此外，对CD8+ Tem的代表性特征(CD44和GZMK)进行免疫组化(IHC)以评估therapy-naïve CRC患者组织样本中的肿瘤浸润情况，发现S组CD44和GZMK的表达明显高于NS组。此外，S组CD44阳性细胞比例和GZMK阳性细胞比例高于NS组。由此来看，血浆和组织蛋白质组学数据显示，高水平的CD8+Tem与西妥昔单抗敏感性相关。

为了进一步探讨CD8+Tem的临床意义，作者将CD8+Tem评分与CT/ MRI评估的肿瘤大小联系起来，结果发现肿瘤大小与CD8+Tem xCell评分呈显著负相关，提示CD8+Tem可能是西妥昔单抗敏感性的潜在标志。为了验证这个结果，作者利用CRC患者的单细胞转录组数据分析CD8+Tem细胞百分比与肿瘤大小相关性，结果显示CD8+Tem细胞的比例与肿瘤大小呈显著负相关，进一步证实CD8+Tem细胞与肿瘤大小的相关性。经CPTAC队列验证，RPTOR和IMPDH2的高表达与预后显著相关。

另外，关键敏感调节因子(RPTOR和IMPDH2）在血浆发现和验证队列中进一步验证得到以上验证。

图 4 西妥昔单抗耐药的潜在机制和生物标志物。

为了进一步确定富含G-I亚型的通路与治疗反应的关系，在S组和NS组之间进行了ssGSEA分析，发现NS组MAPK信号通路、RHO GTPase循环通路和ECM通路的ssGSEA通路评分显著升高，经GSEA验证，NS组这些通路显著富集，表明这些信号通路可能是西妥昔单抗治疗无反应的指标。

在临床上，KRAS突变状态可预测CRC患者对西妥昔单抗治疗的反应。在本研究中，作者发现RRAS和RRAS2高表达的CRC患者更容易对西妥昔单抗产生耐药。为了并探索哪条下游通路在RRAS/RRAS2高表达的同时被激活，作者将队列分为RRAS高表达组和RRAS低表达组。在RRAS高表达组中，MAPK信号通路、RHO通路和ECM通路显著上调。分析参与这些通路的蛋白，发现FBLN1、MMP8、ITGA5与RRAS/ RRAS2呈显著正相关，CPTAC队列验证FBLN1、MMP8、ITGA5高表达与预后不良显著相关。

以上实验表明，RRAS/RRAS2正调控ECM通路，与西妥昔单抗耐药及结直肠癌患者预后不良相关。最后，研究筛选出RRAS2、MMP8、FBLN1、RPTOR和IMPDH2这些蛋白可以作为首次接受西妥昔单抗治疗预后反应蛋白质生物标志物。

3、多疗程西妥昔单抗治疗结直肠癌预测模型的构建与验证

图5 西妥昔单抗对结直肠癌患者连续多个疗程疗效预测模型的建立

多疗程治疗分析，发现首次治疗的预后生物标志物不能作为多疗程治疗的预后标志物。为了找到多疗程治疗的预后生物标志物，作者对SSG和SNSG组的蛋白质进行差异分析，发现各组DEPs变化幅度均为1.5倍，对各组DEPs进行途径富集，SNSG组以糖酵解/糖异生、VEGFA-VERGF2信号通路、Rho GTPases、ECM蛋白聚糖等信号通路为主；SSG组表现为ERBB4信号下调、mRNA剪接、自噬、铁摄取和转运、细胞对热应激的反应、铁凋亡、中性粒细胞脱粒等。最终，作者筛选了一组与结直肠癌患者西妥昔单抗治疗的敏感生物标志物。

同时，也发现了西妥昔单抗治疗在结直肠癌患者中的非敏感生物标志物。K-means分析显示，在西妥昔单抗治疗期间，敏感生物标志物随着采样时间的增加呈逐渐下降趋势，而非敏感生物标志物随着疗程的增加呈逐渐上升趋势。作者利用逐步逻辑回归识别区分SSG和SNSG的特征子集找到了可以预测多疗程治疗的预后反应生物标志物：IDH3G、MDN1、KLC4、MYL9、SBF1和HTRA。

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文章结论

1、本研究为CRC的早期诊断和西妥昔单抗治疗反应的预测提供了新的生物标志物，有助于改善患者的治疗策略。

2、本研究揭示不同生物标志物在结直肠癌诊断、初期反应预测和多疗程反应预测中的异质性。

3、本研究得出的预测模型在预测治疗期间采样时间的反应方面具有稳定的高准确性，有望在临床上得到应用，为CRC患者提供更精准的诊断和治疗选择。

4、本研究在方法学上为生物医学领域提供了一种新的研究方法：通过纵向血浆蛋白质组学分析探索疾病进程和治疗反应。

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