样本想要成功转化成为PCR的结果，前期需要注意的步骤有很多，包括：样本的采集、运送、保存以及核酸提取，每一个步骤都需要小心翼翼，中间的过程可谓是困难重重。样本在转化成PCR结果的过程中，究竟是哪些因素导致转化过程如此艰难呢？下面由小编带着大家一起去扒一扒样本中影响PCR检测的抑制物。

图1.核酸处理与检测流程图

一、PCR抑制物的来源

PCR抑制物的来源包括内源性与外源性两种

1.内源性

天然存在标本中的组成成分。如：免疫球蛋白、蛋白酶、血红蛋白及其代谢产物、血红蛋白中的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、黏蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。

图2.血红蛋白

2.外源性

外部引入的抑制物。如：肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物

图3.抗凝管

二、PCR抑制物一般作用机制

PCR抑制物中大部分的作用机制尚不完全清楚，但基本可以归为三类：

✦1.干扰核酸提取过程中的细胞裂解；

✦2.降解或包裹核酸；

✦3.热稳定DNA聚合酶失活。

1.干扰核酸提取过程中的细胞裂解

细胞裂解，核酸释放使得核酸与酶作用产生扩增。如果细胞裂解不完全，核酸释放不完全，就不会产生扩增。常见的简单处理：煮沸，优点：省时，操作简单。缺点：煮沸释放的DNA有时不能完全与结构蛋白或DNA结合蛋白分离，从而出现扩增抑制作用。单独煮沸的方法会降低扩增敏感性。

2.热稳定DNA聚合酶失活

腐殖化合物是环境样本中最常见的抑制物，其可能是通过对Mg2+的螯合作用而抑制聚合酶活性。

3.降解或包裹核酸

DNA可因为一些物理、化学或酶等因素作用而出现降解，如贮存的扩增产物在扩增后电泳时，有时出现的条带模糊，就是因为DNA的降解所致。DNA的一级结构不稳定，会因为水解、非酶甲基化、氧化损伤和酶降解等出现降解。

细胞中存在核酸酶，如果核酸酶处理不干净，残留在纯化的核酸样本中，从而降解靶核酸。微生物如细菌产生的限制性内切酶也会是一个降解DNA的因素。有些细菌的DNA酶属于热稳定的核酸酶，在扩增中期可水解基因组和引物DNA。

核酸和引物也因为其不能与DNA聚合酶结合而出现不扩增。如蛋白质、多糖、细胞碎片、脂类等对PCR的抑制作用，很可能就是通过对DNA的物理包裹作用而使其不能与聚合酶接触。

乳胶手套上滑石粉对PCR扩增影响可能会通过其对DNA的非特异结合作用进行的。因为DNA可结合至玻璃、二氧化硅等上，这也是采用硅吸附方法提取核酸的基本原理。

图4.DNA核酸

了解完核酸抑制物之后，我们要如何减少这些抑制物对结果的影响呢？主要的技术就是核酸提取。核酸分为DNA和RNA，将其从样本中提取出来，是进行PCR的前提。将复杂样本核酸提取纯化出来，其目的是：

✦1.去除PCR抑制物；

✦2.增加靶核酸浓度，使其能达到特定PCR的测定范围；

✦3.增加样本的均一性，以保证测定的精密度和重复性。

目前，市面上最常见的核酸提取方法包括柱式提取方法和磁珠提取方法。一直以来，诺唯赞为DNA和RNA高效提取提供支持，下面由小编介绍一下诺唯赞的全自动核酸提取仪。它是一款高通量、高精度运行的核酸提取设备，搭配基于超顺磁性硅基磁珠预封装提取试剂，可从血液，组织，口腔液等多种生物样品提取和纯化核酸。该仪器通过磁棒的吸附、转移和释放磁珠，实现核酸纯化和富集。操作自动化程度高、快速简便，广泛应用于分子诊断和动物疫病检测领域。

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参考文献：

[1]李金明，王静.实时荧光PCR技术（第2版）.北京：科学出版社，2016：70-72

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