专利名称：富集叠氮标记生物大分子的磁性纳米材料及其制备与应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及一种富集叠氮标记生物大分子的磁性纳米材料及其制备与应用，具体地讲，是涉及一种基于炔基及二硫键修饰的磁性纳米材料以及利用该材料富集叠氮标记生物大分子的新方法。

背景技术：

1.蛋白质O-GalNAc糖基化与生物正交性活体代谢标记蛋白质的糖基化是糖链(或单个单糖)在糖基转移酶作用下结合到蛋白质特定氨基酸残基上的一种修饰。据估计细胞中50%以上的蛋白质具有糖基化现象[Hagglimd， P.，et al.，A new strategy for identification of N—glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. Journal of Proteome Research,2004.3(3) :p. 556-566.]0 糖基化修饰对蛋白质的结构功能起重要的调控作用，与各种生理现象密切相关，例如影响蛋白质的构象和折叠，进而参与各种识别过程[Varki，Α.，Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 2007. 446 (7139) p. 1023-1029.]。但由于存在微不均一性等原因，对蛋白质糖基化的分析曾是非常困难的。近年来有许多方法学的进展，使得蛋白质糖基化的研究逐渐变得可行[Marino， K., et al., A systematic approach to protein glycosylation analysis :a path through the maze. Nature Chemical Biology, 2010. 6 (10) :p. 713—723.]。蛋白质的糖基化修饰主要有N-糖基化和0-糖基化两种形式。蛋白质的N-糖基化有较多的保守特征，因此较容易分析。在最近的研究中，Marm等从小鼠组织和血浆中鉴定了 2353个蛋白

6367 N- 11 ^^ ^ [Zielinska, D. F. , et al. , Precision Mapping of an In Vivo N-Glycoproteome Reveals Rigid Topological and Sequence Constraints. Cell, 2010. 141(5) :p. 897-907.]。蛋白质 0-糖基化形式有 0-GlcNAc、O-Mannose, O-Fucose, 0-Glucose, O-Xylose等形式，其中最主要的是以O-GalNAc起始的黏蛋白型的0_糖基化。O-GalNAc有重要的生物学功能。例如O-GalNac起始的Core 1结构大量分布在发育分化后神经元轴突表面[Wu, A.M. ， et al. ， Differential binding properties of Gal/ GalNAcspecific lectins available for characterization of glycoreceptors. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics，1997. 3 (1—2) :p. 61—71.]；在细胞癌变与肿瘤发展过程中常常伴随有O-GalNAc糖基化的变化，因此，O-GalNAc糖基化的结构研究具有重要意义。

但是由于蛋白质的O-GalNAc糖基化修饰不具有规律和保守性，其结构复杂，从分离富集到质谱鉴定都存在许多问题[Wang，S.，X. Zou, and Y. Zhang, Mass Spectrometry Based Analysis of Protein 0-glycosylation. Progress in Chemistry,2010. 22 (12) p. 2428-2435.]。利用生物正交性标记方法为蛋白质糖基化研究提供了新的突破途径。近年来生物正交性活体代谢标记技术获得了广泛的应用，如生物正交性非经典氨基酸标记(BONCAT)技术[Dieterich，D. C.，et al.，Selective identification ofnewly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006. 103(25) :p. 9482-9487.]，以及天然单糖叠氮类似物标记的技术[Laughlin，S. Τ· and C. R. Bertozzi, Imaging the glycome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009. 106(1) p. 12-17.]。

这些技术的成功是基于叠氮(或炔基)的独特性质1)叠氮(或炔基)的体积很小，对被标记的生物大分子的物理化学性质影响较小，基本不会改变生物大分子的代谢和生化途径。例如(^alNAz (单糖(ialNAc的一种叠氮类似物)可以和(ialNAc —样被糖基转移酶利用，对蛋白进行O-GalNAc糖基化修饰，以至形成叠氮标记的0-糖基化蛋白[Dube, D. H.，et al.，Probing mucin-type 0-linked glycosylation in living animals.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006. 103(13) :p. 4819-4824.]。又例如 L-azidohomoalanine 可以被蛋白合成系统当作蛋氨酸(Methionine)，进而对蛋白进行叠氮标记[Dieterich，D. C.，et al.， Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006. 103(25) p. 9482-9487. ]。

2)叠氮(或炔基)在生物体内基本保持惰性，不与生物体内的其他物质发生反应。可进行叠氮(或炔基)特异性的化学反应，如叠氮可以和Wiosphine发生反应 [Laughlin,S. Τ. and C. R. Bertozzi,Metabolic labeling of glycans with azido sugars andsubsequent glycan—profiling and visualization via Staudinger ligation. Nature Protocols，2007. 2 (11) :p.四30_2944.]，叠氮可以和炔基发生铜催化的环加成反应[Demko, Z. P. and K. B. Sharpless, A click chemistry approach to tetrazoles by Huisgen l，3_dipolar cycloaddition :Synthesis of 5~acyltetrazoIes from azides and acyl cyanides. Angewandte Chemie-International Edition,2002. 41 (12) p. 2113-2116.]。

这些反应都是高度化学选择性的，便利后续的检测分析。但针对被叠氮标记生物大分子的富集，最适宜的反应仍是Cu(I)催化的末端炔基与叠氮的点击环加成化学反应。[Besanceney—ffebler，C.，et al. , Increasing the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation :A Comparative Study, Angewandte Chemie International Edition, DOI :10.1002/anie. 201101817]。在对生物体进行生物正交性标记以后，叠氮基团进入生物合成途径，并出现在相应的蛋白质上。通过后续的叠氮特异性反应，将荧光基团与含有叠氮的分子相连接，从而跟踪叠氮标记的分子。例如Bertozzi等采用了 Ac4GalNAz对蛋白的0_糖链进行叠氮标记，并进一步使用荧光试剂以跟踪显示新合成的0-糖链[Laughlin，S. Τ.，et al.，In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science, 2008.320 (5876) :p. 664-667.]。

2.富集手段生物正交性标记加荧光检测的方法能获取的信息十分有限。为了真正解决生物学问题，解析糖基化或其他相关生物大分子的功能，必须鉴定这些标记了叠氮基团的蛋白 (多肽)。由于在细胞中被叠氮标记的蛋白含量很少，首先需要解决利用叠氮基团修饰的蛋白(多肽)的富集问题。现有的针对叠氮修饰蛋白(多肽)的富集技术主要有如下几种1)利用叠氮特异性的反应使这些蛋白通过与生物素和亲和素结合的亲和纯化技术，富集标记蛋白。为了提高本策略的效率，出现了一些易于断裂的生物素试剂。这种试剂一般是线性分子， 一端是生物素，另一端是叠氮反应性基团，中间是容易断裂的基团[Szychowski，J.，et al. ， Cleavable Biotin Probes for Labeling of Biomolecules via Azide-Alkyne Cycloaddition.Journal of the American Chemical Society,2010.132(51) p.18351-18360. ][Zaro, B. W. ,et al. , Chemical reporters for fluorescent detection and identification of 0-GlcNAc—modified proteins reveal glycosylation of the ubiquitin ligase NEDD4-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011. 108(20) :p. 8146-8151. ]。

2)将叠氮反应性基团(例如环辛炔)和容易断裂的二硫键基团固定在高聚物上，从而实现富集分离的目的[Nessen， Μ. Α. , et al. , Selective Enrichment of Azide-Containing Peptides from Complex Mixtures. Journal of Proteome Research, 2009. 8 (7) :p. 3702—3711. ]。3)利用叠氮被还原生成氨基根据相关物质色谱保留值的改变而进行目标蛋白的富集分离[Kramer，G.，et al. , Identification andQuantitation of Newly Synthesized Proteins in Escherichia coli by Enrichment of Azidohomoalanine-labeled Peptides with Diagonal Chromatography. Molecular & Cellular Proteomics, 2009. 8 (7) :p. 1599-1611.]。但这些富集方法存在操作步骤较多、操作不便的缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种基于炔基及二硫键修饰的磁性纳米材料以及利用该材料富集叠氮标记生物大分子的新方法，以简化现有技术中富集分离叠氮标记生物大分子的操作过程。本发明提出了一种与已报道的方法不同的利用磁性纳米材料分离生物正交性 (叠氮)标记大分子的方法将末端炔基通过可断裂的二硫键基团固定在超顺磁性磁珠上， 首先制备出特殊化学修饰的超顺磁性纳米材料(磁珠)，然后再利用该磁珠的超顺磁性和磁珠表面的特异性修饰达到富集分离生物大分子的目的。为达到上述目的，本发明一方面提供了一种富集叠氮标记生物大分子的磁性纳米材料，采用的技术方案如下一种磁性纳米材料，其特征在于，包括SiA包覆的磁性I^e3O4纳米颗粒，且该SiA 包覆的磁性狗304纳米颗粒的表面共价连接含有可断裂基团的分子；所述含有可断裂基团的分子的末端为可与叠氮特异性反应的基团。所述含有可断裂基团的分子是指，可断裂基团的两端分别通过具有一定结构的分子结构单元，连接于SiO2包覆的磁性!^e3O4纳米颗粒的表面和可与叠氮特异性反应的基团 (末端炔基)。较佳的，所述可断裂基团选用二硫键；所述可与叠氮特异性反应的基团选用末端为炔基的基团。即所述含有可断裂基团的分子中，二硫键的两端分别通过具有一定结构的分子结构单元，连接于Sih包覆的磁性!^e3O4纳米颗粒的表面和末端炔基上。

较佳的，所述末端为炔基的基团可以是具有如下结构式的基团HC = C-R其中R选自以下基团任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的 C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-Cw芳基和任选取代或未取代的

杂芳基。较佳的，所述可断裂基团的结构通式如式(I)所示

权利要求

1.一种磁性纳米材料，其特征在于，包括SW2包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒，且该SW2包覆的磁性!^e3O4纳米颗粒的表面共价连接含有可断裂基团的分子；所述含有可断裂基团的分子的末端为可与叠氮特异性反应的基团。

2.如权利要求1所述的磁性纳米材料，其特征在于，所述可断裂基团选用二硫键；所述可与叠氮特异性反应的基团选用末端为炔基的基团。

3.如权利要求1所述的磁性纳米材料，其特征在于，所述含有可断裂基团的结构式如下

4.如权利要求3所述的磁性纳米材料，其特征在于，R1和&分别为含有酰胺键的基团。

5.如权利要求4所述的磁性纳米材料，其特征在于，所述含有可断裂基团的分子的结构式如下

6.如权利要求5所述的磁性纳米材料，其特征在于，R、R4和&均为任选取代或未取代的C1-C12焼基。

7.如权利要求6所述的磁性纳米材料，其特征在于，m= 3, η = 3 ；R任选取代或未取代的C2-C5烷基；R4和&均为乙基。

8.如权利要求4所述的磁性纳米材料，其特征在于，所述含有可断裂基团的分子的结构式如下

9.如权利要求8所述的磁性纳米材料，其特征在于，R、R4和&分别任选取代或未取代的C1-C12焼基。

10.如权利要求9所述的磁性纳米材料，其特征在于，m= 3;R任选取代或未取代的 C2-C5烷基；R4和R5均为甲基。

11.如权利要求3所述的磁性纳米材料，其特征在于，所述含有可断裂基团的分子的结构式如下式中m为2-10的整数；R3是SW2包覆的磁性1 纳米颗粒表面上的二氧化硅网络；R、R4和&分别选自以下基团任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的 C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-Cw芳基和任选取代或未取代的 C1-C18杂芳基；R6和R7分别选自以下基团氢、任选取代或未取代的C1-C12烷基、任选取代或未取代的 C2-C12烯基、任选取代或未取代的C2-C12杂烷基、任选取代或未取代的C3-C12环烷基、任选取代或未取代的C2-C12杂环烷基、任选取代或未取代的C6-Cw芳基和任选取代或未取代的杂芳基。

12.如权利要求11所述的磁性纳米材料，其特征在于，R、R4和&均为任选取代或未取代的C1-C12烷基；R6和R7均为氢、取代或未取代的C1-C12烷基。

13.如权利要求12所述的磁性纳米材料，其特征在于，m= 3 ；R任选取代或未取代的 C2-C5烷基;R4和R5均为甲基;R6和R7均为氢。

14.如权利要求1-13任一所述的磁性纳米材料，其特征在于，所述SiO2包覆的磁性 Fe3O4纳米颗粒的直径为50 1500nm，SiO2包覆层的厚度为5 lOOnm。

15.如权利要求1-14任一所述的磁性纳米材料的用途，其特征在于，所述磁性纳米材料用于富集叠氮基团标记的生物大分子。

16.如权利要求15所述的磁性纳米材料的用途，其特征在于，所述叠氮基团来自 GalNAz,ManNAz,GlcNAz,6-AzFuc, SiaNAz和AHA，所述生物大分子选自糖脂、糖肽、多肽、蛋白和核酸。

17.一种富集叠氮标记生物大分子的方法，包括如下步骤1)将如权利要求1-14任一所述的磁性纳米材料与被叠氮基团修饰的生物大分子物质混合，在PH为6. 5-8的溶液中，进行Cu (I)催化点击化学反应，使叠氮基团与所述磁性纳米材料表面的可与叠氮特异性反应的基团形成共价连接；2)去除磁性纳米材料表面未被共价结合的分子；然后采用还原的条件断裂磁性纳米材料表面的可断裂基团；最后游离洗脱富集在磁性纳米材料表面的目的分子。

全文摘要

本发明提供了一种新的表面化学修饰磁性材料以及利用该材料富集叠氮标记生物大分子的方法。本发明将磁性纳米材料与现有技术中的分离策略相结合，将末端炔基通过可断裂的基团固定在超顺磁性磁珠上，形成含有末端炔基的新型表面修饰磁珠。此外，还通过Cu(I)催化点击化学反应，使叠氮基团与磁珠表面炔基形成共价键；利用磁珠的超顺磁性，富集和分离被共价结合的物质；最后通过断裂磁珠表面的可断裂基团，游离含叠氮标记的生物大分子，达到富集叠氮基团标记的生物大分子的目的。与现有技术相比，具有操作简化，效率提高的优点。

文档编号B82Y25/00GK102412046SQ20111023672

公开日2012年4月11日 申请日期2011年8月17日 优先权日2011年8月17日

发明者张延 , 王胜, 谢文娴 申请人:上海交通大学